วิธีการ transfect tet - 213 เซลล์?

transfection เป็นเทคนิคที่สำคัญในชีววิทยาโมเลกุลที่ช่วยให้การแนะนำของกรดนิวคลีอิกต่างประเทศเข้าสู่เซลล์ทำให้นักวิจัยสามารถศึกษาการทำงานของยีนการแสดงออกของโปรตีนและเส้นทางการส่งสัญญาณของเซลล์ เซลล์ TET-213 ซึ่งเป็นเซลล์ neuroblastoma ของมนุษย์มักใช้ในการวิจัยประสาทวิทยาศาสตร์เนื่องจากคุณสมบัติของเซลล์ประสาท ในโพสต์บล็อกนี้ฉันจะแบ่งปันข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับวิธีการ transfect TET-213 เซลล์อย่างมีประสิทธิภาพโดยวาดประสบการณ์ของฉันในฐานะผู้จัดหาเซลล์ TET-213

ทำความเข้าใจเซลล์ TET-213

ก่อนที่จะเจาะลึกลงไปในกระบวนการ transfection สิ่งสำคัญคือต้องเข้าใจลักษณะของเซลล์ TET-213 เซลล์เหล่านี้ได้มาจาก neuroblastoma ของมนุษย์และแสดงคุณสมบัติของเซลล์ประสาทเช่นความสามารถในการขยายเซลล์ประสาทและเครื่องหมายเซลล์ประสาท พวกเขาเป็นเซลล์ที่ยึดมั่นซึ่งเติบโตได้ดีในสภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์มาตรฐานโดยทั่วไปจะอยู่ในสื่อเสริมด้วยเซรั่มของทารกในครรภ์ (FBS) และยาปฏิชีวนะ

การเลือกวิธีการถ่ายโอนที่เหมาะสม

มีหลายวิธีสำหรับเซลล์ transfecting แต่ละเซลล์มีข้อดีและข้อ จำกัด ของตัวเอง ทางเลือกของวิธีการ transfection ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่าง ๆ รวมถึงชนิดของกรดนิวคลีอิกที่จะถ่าย transfected ชนิดของเซลล์และประสิทธิภาพการถ่ายเลือดที่ต้องการ นี่คือวิธีการ transfection ทั่วไปที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ TET-213:

การถ่ายไขมัน

transfection ที่ใช้ไขมันเป็นหนึ่งในวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดสำหรับการแนะนำกรดนิวคลีอิกเข้าสู่เซลล์ มันเกี่ยวข้องกับการใช้รีเอเจนต์ที่ใช้ไขมันซึ่งก่อให้เกิดคอมเพล็กซ์กับกรดนิวคลีอิกซึ่งจะถูกนำขึ้นโดยเซลล์ผ่าน endocytosis การถ่ายเลือดที่ใช้ไขมันนั้นค่อนข้างง่ายต่อการทำงานและสามารถบรรลุประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงสูงในเซลล์หลายประเภทรวมถึงเซลล์ TET-213

การใช้ไฟฟ้า

Electroporation เป็นวิธีทางกายภาพที่ใช้สนามไฟฟ้าเพื่อสร้างรูขุมขนชั่วคราวในเยื่อหุ้มเซลล์ทำให้กรดนิวคลีอิกเข้าสู่เซลล์ วิธีนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับเซลล์ transfecting ที่ยากต่อการถ่ายโอนโดยใช้วิธีการอื่นเช่นเซลล์หลัก อย่างไรก็ตามการไฟฟ้าสามารถสร้างความเสียหายให้กับเซลล์ได้มากขึ้นและอาจต้องเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์การใช้ไฟฟ้าเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการถ่ายโอนสูง

การถ่ายโอนไวรัส

การถ่ายโอนไวรัสเกี่ยวข้องกับการใช้เวกเตอร์ไวรัสเพื่อส่งกรดนิวคลีอิกเข้าสู่เซลล์ เวกเตอร์ไวรัสมาจากไวรัสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมเพื่อนำกรดนิวคลีอิกที่ต้องการและสามารถติดเชื้อเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การถ่ายโอนไวรัสสามารถบรรลุประสิทธิภาพการถ่ายโอนสูงและสามารถใช้ในการถ่ายเซลล์ชนิดที่หลากหลายรวมถึงเซลล์ TET-213 อย่างไรก็ตามการถ่ายโอนไวรัสต้องใช้อุปกรณ์และความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านและมีข้อกังวลด้านความปลอดภัยที่อาจเกิดขึ้นที่เกี่ยวข้องกับการใช้เวกเตอร์ไวรัส

การเตรียมเซลล์สำหรับการถ่ายเลือด

การเตรียมเซลล์ที่เหมาะสมเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการถ่ายเลือดที่ประสบความสำเร็จ นี่คือขั้นตอนบางอย่างที่จะปฏิบัติตามเมื่อเตรียมเซลล์ TET-213 สำหรับการถ่ายโอน:

การเพาะเลี้ยงเซลล์

รักษาเซลล์ TET-213 ในสื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เหมาะสมซึ่งเสริมด้วย FBS และยาปฏิชีวนะ ผ่านเซลล์อย่างสม่ำเสมอเพื่อรักษาขั้นตอนการเจริญเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล สิ่งสำคัญคือการใช้เซลล์ที่มีสุขภาพดีและเติบโตอย่างแข็งขันสำหรับการถ่ายเลือดเนื่องจากเซลล์ในสภาวะทางสรีรวิทยาที่ไม่ดีอาจมีประสิทธิภาพการถ่ายเลือดต่ำกว่า

การเพาะเซลล์

เมล็ดเซลล์ TET-213 ในจานเพาะเลี้ยงหรือจานหลายหลุมที่ความหนาแน่นที่เหมาะสม ความหนาแน่นของการเพาะขึ้นอยู่กับวิธีการถ่ายและประเภทของการทดลอง สำหรับ transfection ที่ใช้ไขมันจะแนะนำให้ใช้ความหนาแน่นของการเพาะเมล็ด 50-80%

การฟักตัวของเซลล์

บ่มเซลล์ที่มีเมล็ดในตู้อบที่มีความชื้นที่ 37 ° C ด้วย 5% CO2 เป็นเวลาอย่างน้อย 24 ชั่วโมงก่อนการถ่ายเลือดเพื่อให้เซลล์สามารถแนบและกู้คืนจากกระบวนการเพาะ

การถ่ายภาพ

เมื่อเซลล์ถูกเตรียมแล้วก็ถึงเวลาที่จะทำการถ่าย นี่คือโปรโตคอลทั่วไปสำหรับการถ่ายไขมันในเซลล์ TET-213:

เตรียมรีเอเจนต์ transfection

ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิตเพื่อเตรียมรีเอเจนต์ transfection ที่ใช้ไขมัน โดยทั่วไปแล้วสิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการเจือจางรีเอเจนต์ในสื่อการเปลี่ยนถ่ายที่เหมาะสม

เตรียมกรดนิวคลีอิก

เตรียมกรดนิวคลีอิกให้ถ่ายเช่นพลาสมิดดีเอ็นเอหรือ siRNA เจือจางกรดนิวคลีอิกในตัวกลาง transfection ที่เหมาะสม

สร้าง transfection complex

ผสมรีเอเจนต์ transfection ที่เจือจางและกรดนิวคลีอิกเจือจางในหลอดและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15-30 นาทีเพื่อให้เกิดการก่อตัวของการถ่ายเลือด

เพิ่ม transfection complex ไปยังเซลล์

ลบสื่อการเพาะเลี้ยงออกจากเซลล์และแทนที่ด้วยสื่อการถ่ายเลือดสด เพิ่มการถ่ายโอนคอมเพล็กซ์ลงในเซลล์ลดลงอย่างชาญฉลาดและหมุนจานเบา ๆ เพื่อแจกจ่ายคอมเพล็กซ์อย่างสม่ำเสมอ

บ่มเซลล์

บ่มเซลล์ transfected ในตู้อบที่มีความชื้นที่ 37 ° C ด้วย 5% CO2 ในระยะเวลาที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับชนิดของกรดนิวคลีอิกและการทดลอง สำหรับการถ่าย DNA พลาสมิดเวลาบ่มเวลา 24-48 ชั่วโมงมักจะเพียงพอที่จะอนุญาตให้มีการแสดงออกของยีน

การประเมินประสิทธิภาพการถ่ายเลือด

หลังจากการถ่ายโอนสิ่งสำคัญคือการประเมินประสิทธิภาพการถ่ายเลือดเพื่อตรวจสอบว่าการถ่ายเลือดประสบความสำเร็จหรือไม่ มีหลายวิธีในการประเมินประสิทธิภาพการถ่ายเลือดรวมถึง:

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

หากกรดนิวคลีอิก transfected เข้ารหัสโปรตีนเรืองแสงเช่น GFP กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์สามารถใช้ในการมองเห็นเซลล์ transfected เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ฟลูออเรสเซนต์สามารถใช้เป็นค่าประมาณของประสิทธิภาพการถ่ายเลือด

โฟลว์ไซโตเมทรี

Flow cytometry สามารถใช้ในการหาปริมาณเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ transfected ตามการแสดงออกของเครื่องหมายฟลูออเรสเซนต์หรือแอนติเจนของเซลล์ผิว วิธีนี้ให้การวัดประสิทธิภาพการถ่ายเลือดที่แม่นยำและมีปริมาณมากขึ้นเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์

blotting ตะวันตกหรือ qpcr

หากกรดนิวคลีอิก transfected เข้ารหัสโปรตีนที่น่าสนใจสามารถใช้ blotting ตะวันตกหรือ qPCR เพื่อตรวจจับการแสดงออกของโปรตีนในระดับโปรตีนหรือ mRNA ตามลำดับ วิธีนี้สามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับระดับการแสดงออกของยีนและการทำงานของโปรตีน transfected

การแก้ไขปัญหาปัญหาการถ่ายเลือดร่วมกัน

บางครั้งการถ่ายเลือดอาจเป็นเรื่องที่ท้าทายและมีปัญหาทั่วไปหลายประการที่อาจเกิดขึ้น นี่คือเคล็ดลับการแก้ไขปัญหาบางอย่างสำหรับปัญหาการถ่ายภาพทั่วไป:

ประสิทธิภาพการถ่ายเลือดต่ำ

ตรวจสอบคุณภาพและปริมาณของกรดนิวคลีอิก ตรวจสอบให้แน่ใจว่ากรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์และมีคุณภาพสูง
เพิ่มประสิทธิภาพเงื่อนไขการถ่ายเลือดเช่นความเข้มข้นของรีเอเจนต์ transfection อัตราส่วนกรดต่ออัตราส่วนนิวคลีอิกและเวลาการบ่ม
ตรวจสอบสุขภาพของเซลล์และความมีชีวิต ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเซลล์มีสุขภาพดีและเติบโตอย่างแข็งขันก่อนการถ่ายเลือด
ลองใช้วิธีการถ่ายภาพหรือรีเอเจนต์อื่น

ความเป็นพิษของเซลล์

ลดความเข้มข้นของรีเอเจนต์ transfection หรือกรดนิวคลีอิก
เพิ่มประสิทธิภาพเงื่อนไขการถ่ายเลือดเพื่อลดความเสียหายของเซลล์
ใช้วิธีการ transfection ที่แตกต่างกันหรือรีเอเจนต์ที่มีพิษน้อยกว่าเซลล์

ประสิทธิภาพการเปลี่ยนถ่ายแปรปรวน

ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเซลล์มีการเพาะอย่างสม่ำเสมอและมีความหนาแน่นที่เหมาะสม
ผสม transfection complex อย่างละเอียดก่อนที่จะเพิ่มลงในเซลล์
บ่มเซลล์ภายใต้เงื่อนไขที่สอดคล้องกันเพื่อลดความแปรปรวน

บทสรุป

transfecting TET-213 เซลล์อาจเป็นกระบวนการที่ท้าทาย แต่ให้รางวัล โดยการเลือกวิธีการถ่ายโอนที่เหมาะสมการเตรียมเซลล์อย่างถูกต้องและทำตามโปรโตคอลที่เหมาะสมคุณสามารถบรรลุประสิทธิภาพการถ่ายโอนที่สูงและได้รับผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ หากคุณมีคำถามใด ๆ หรือต้องการความช่วยเหลือเพิ่มเติมเกี่ยวกับการถ่ายเซลล์ TET-213 โปรดอย่าลังเลที่จะติดต่อเรา เราเป็นซัพพลายเออร์ชั้นนำของเซลล์ TET-213 และสามารถให้เซลล์คุณภาพสูง, รีเอเจนต์ transfection และการสนับสนุนทางเทคนิค

นอกจากเซลล์ TET-213 แล้วเรายังนำเสนอเปปไทด์ที่หลากหลายรวมถึงGalanan (มนุษย์)-Cyclo (RGDFC), และDynorphin A (1-13), Amide, Morcine- เปปไทด์เหล่านี้สามารถใช้ในการใช้งานวิจัยต่าง ๆ เช่นประสาทวิทยาศาสตร์การวิจัยโรคมะเร็งและการค้นพบยา

หากคุณสนใจที่จะซื้อเซลล์ TET-213 หรือเปปไทด์ใด ๆ ของเราโปรดติดต่อเราเพื่อหารือเกี่ยวกับความต้องการเฉพาะของคุณ เราหวังว่าจะได้ทำงานร่วมกับคุณและช่วยให้คุณบรรลุเป้าหมายการวิจัย

การอ้างอิง

Sambrook, J. , & Russell, DW (2001) การโคลนนิ่งโมเลกุล: คู่มือห้องปฏิบัติการ สำนักพิมพ์ห้องปฏิบัติการ Cold Spring Harbour
Ausubel, FM, Brent, R. , Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (บรรณาธิการ) (2002) โปรโตคอลปัจจุบันในชีววิทยาโมเลกุล John Wiley & Sons
Chen, C. , & Okayama, H. (1987) การเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพสูงของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยพลาสมิดดีเอ็นเอ ชีววิทยาโมเลกุลและเซลลูลาร์, 7 (8), 2745-2752
Neumann, E. , Schaefer-Ridder, M. , Wang, Y. , & Hofschneider, PH (1982) การถ่ายโอนยีนไปยังเซลล์เมาส์ Lyoma โดยการไฟฟ้าในสนามไฟฟ้าสูง Embo Journal, 1 (7), 841-845
Naldini, L. , Blomer, U. , Gallay, P. , Ory, D. , Mulligan, R. , Gage, Fh, ... & Verma, IM (1996) ในการส่งยีนของร่างกายและการถ่ายทอดเซลล์ที่ไม่ได้รับการแบ่งแยกโดยเวกเตอร์ lentiviral วิทยาศาสตร์, 272 (5259), 263-267

บทความ