การสังเคราะห์เปปไทด์คืออะไร

 

การสังเคราะห์เปปไทด์เป็นสาขาสำคัญในโปรตีนและเคมีเปปไทด์ ซึ่งโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการเติมกรดอะมิโนตามลำดับตามลำดับที่กำหนดเพื่อสร้างสายโซ่เปปไทด์โดยวิธีทางเคมี วิธีการสังเคราะห์หลักคือการสังเคราะห์เฟสของเหลวและเฟสของแข็ง เมื่อเปรียบเทียบกับ LPPS แล้ว SPPS มีข้อดีคือเร็วกว่า ง่ายกว่า มีปฏิกิริยาข้างเคียงน้อยกว่า และให้ผลตอบแทนสูงกว่า

 

วิธี SPPS มาตรฐาน รวมถึงกลยุทธ์ Boc (เบนซิล) และ Fmoc (tBu)

 

 

กลยุทธ์บอค(เบนซิล)

ในวิธีการสังเคราะห์นี้ เรซินคลอโรเมทิลเลต, ไฮดรอกซีเมทิลเลตโพลิสไตรีน และพี-เมทอกซีเบนซิล (PMA) ถูกใช้เป็นตัวรองรับที่เป็นของแข็ง หมู่อะมิโนได้รับการปกป้องด้วย t-บิวทอกซีคาร์บอนิล (Boc) ในขณะที่กลุ่มสายด้านข้างของกรดอะมิโนได้รับการปกป้องด้วยอนุพันธ์เบนซิล หมู่ Boc ถูกดึงออกโดยใช้ TFA หรือ TFA เรียบร้อยใน CH2Cl2 และที่จุดสิ้นสุดของการสังเคราะห์ หมู่ป้องกันสายโซ่ด้านข้างและจุดเชื่อมต่อเปปไทด์-เรซินถูกกำจัดออกด้วยกรดแก่ เช่น กรดแอนไฮดรัส ไฮโดรฟลูออริก (HF) หรือ TFMSA

 

กลยุทธ์ Fmoc (tBu)

ในวิธีการสังเคราะห์นี้ Wang-resin, 2-Chlorotrityl Chloride Resin, Rink amide-AM Resins, Rink amide-MBHA Resins ถูกนำมาใช้เป็นตัวรองรับที่เป็นของแข็ง หมู่ -อะมิโนได้รับการปกป้องด้วย 9-ฟลูออเรนิลเมทอกซีคาร์บอนิล (Fmoc ) ในขณะที่หมู่สายด้านข้างของกรดอะมิโนถูกป้องกันด้วยหมู่ป้องกันกรดที่ไม่ละลายน้ำ หมู่ Fmoc ถูกกำจัดออกโดยใช้พิเพอริดีน 20% ใน DMF และที่จุดสิ้นสุดของการสังเคราะห์ หมู่ป้องกันสายโซ่ด้านข้างและส่วนเชื่อมต่อเปปไทด์-เรซินจะถูกกำจัดออกด้วย TFA 1%-95% ปัจจุบัน Fmoc SPPS เป็นวิธีที่ต้องการสำหรับการสังเคราะห์เปปไทด์

 

หลักการพื้นฐานของการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็งของ Fmoc

 

เลือกเรซิน

เรซินที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดใน Fmoc SPPS ได้แก่ เรซิน 4-อัลคอกซีเบนซิลแอลกอฮอล์ (Wang), 2-เรซินคลอโรไตรทิลคลอไรด์, เรซิน Rink Amide, เรซิน Rink Amide-MBHA เอไมด์เรซินใช้สำหรับการสังเคราะห์เปปไทด์ที่มีการอะมิเดชั่นที่ปลาย C ที่ต้องการ โดยทั่วไปจะใช้เรซิน Wang และ 2-Cl Trt สำหรับการสังเคราะห์เปปไทด์ที่มี COOH ที่ไม่มีเทอร์มินัล C ที่ต้องการ แต่เมื่อปลาย C ของเปปไทด์มี Pro และ Gly เป็นกรดอะมิโนตัวแรก ไม่ควรใช้เรซิน Wang เนื่องจากมีความเสี่ยงต่อการเกิด DKP (ไดคีโทพิเพอราซีน) จึงแนะนำให้ใช้ 2-คลอโรไตรทิล คลอไรด์ เรซิน

 

 

การเกาะติดของกรดอะมิโนที่ได้รับการป้องกันกับเรซิน

กรดอะมิโน Fmoc ตัวแรกติดอยู่กับเรซินรองรับที่ไม่ละลายน้ำผ่านทางตัวเชื่อมโยงที่ไม่ละลายน้ำ

 

การปลดการป้องกันหมู่ป้องกัน -อะมิโน

กลุ่มป้องกัน Fmoc ชั่วคราวที่ปลาย N ของเพปติดิล-เรซินจะถูกกำจัดออกโดยการบำบัดด้วยสารละลายพิเพอริดีน 20% ใน DMF ปฏิกิริยานี้มักจะเสร็จสิ้นภายใน 10 ถึง 20 นาที

 

ขั้นตอนการซัก

หลังจากทำปฏิกิริยาทางเคมีแต่ละครั้ง ขั้นตอนการล้างจะดำเนินการเพื่อกำจัดรีเอเจนต์ ผลพลอยได้ และโมเลกุลที่ไม่ทำปฏิกิริยาส่วนเกินออกจากเรซิน ซึ่งจะช่วยรักษาความบริสุทธิ์ของสายโซ่เปปไทด์ที่กำลังเติบโต

 

การกระตุ้นและการเชื่อมต่อของกรดอะมิโนที่ได้รับการป้องกัน

กรดอะมิโนที่ได้รับการป้องกันที่จับกับเรซินถูกกระตุ้นเพื่อเพิ่มความสามารถในการทำปฏิกิริยาสำหรับการควบคู่กับกรดอะมิโนตัวถัดไปในลำดับ สารกระตุ้นทั่วไป ได้แก่ HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU และ HATU การมีเพศสัมพันธ์เกี่ยวข้องกับการสร้างพันธะเปปไทด์ระหว่างกรดอะมิโนที่ถูกกระตุ้นและกลุ่มอะมิโนของสายเปปไทด์ที่กำลังเติบโต โดยทั่วไปจะใช้การทดสอบ Kaiser เพื่อติดตามความสมบูรณ์ของปฏิกิริยาคัปปลิ้ง

 

ขั้นตอนการซัก

เช่นเดียวกับขั้นตอนการล้างก่อนหน้านี้ ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการกำจัดรีเอเจนต์และผลพลอยได้ส่วนเกินหลังปฏิกิริยาคัปปลิ้ง

 

การแตกแยกจากเรซินและการปลดการป้องกันของกลุ่มป้องกันโซ่ด้านข้าง

เมื่อลำดับเปปไทด์ที่ต้องการถูกสังเคราะห์บนเรซิน จะถูกแยกออกจากส่วนรองรับที่เป็นของแข็งโดยใช้ค็อกเทลสำหรับการตัดแยก เช่น กรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) ที่มีสารกำจัดขยะ เช่น ไทโออะนิโซลและน้ำ ในขณะเดียวกัน กลุ่มป้องกันสายโซ่ด้านข้างบนเรซิดิวของกรดอะมิโนจะถูกกำจัดออก ซึ่งเผยให้เห็นเปปไทด์ที่ได้รับการปกป้องอย่างสมบูรณ์ซึ่งพร้อมสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และการวิเคราะห์