วิธีการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์บน TET - 213 เซลล์?

เฮ้ ฉันเป็นซัพพลายเออร์ของ TET - 213 เซลล์และวันนี้ฉันจะพาคุณผ่านวิธีการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ในเซลล์เหล่านี้ การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เป็นเทคนิคที่มีประโยชน์มากในโลกของชีววิทยาเซลล์ มันช่วยให้เราเห็นภาพโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงภายในเซลล์ทำให้เราเข้าใจฟังก์ชั่นและสถานที่ของพวกเขาได้ดีขึ้น

การเตรียมเซลล์ TET - 213 เซลล์

สิ่งแรกสิ่งแรกเราต้องเตรียม TET - 213 เซลล์ให้พร้อม เริ่มต้นด้วยการเติบโตในสื่อวัฒนธรรมที่เหมาะสม เซลล์เหล่านี้มักจะทำได้ดีในสื่อเช่น RPMI 1640 เสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10% (FBS) และ 1% เพนิซิลลิน - สเตรปโตมัยซิน บ่มเซลล์ที่ 37 ° C ในบรรยากาศ 5% CO₂

เมื่อเซลล์ไปถึงการบรรจบกันประมาณ 70 - 80% ก็ถึงเวลาที่จะเริ่มกระบวนการย้อมสี คุณจะต้องเมล็ดเซลล์ลงบนฝาครอบในแผ่น 24 - ดี สิ่งนี้ทำให้ง่ายต่อการจัดการเซลล์ในระหว่างขั้นตอนการย้อมสี ใช้ปิเปตเพื่อถ่ายโอนการระงับเซลล์อย่างระมัดระวังไปยังฝาครอบ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้กระจายเซลล์อย่างสม่ำเสมอ

แก้ไขเซลล์

หลังจากที่เซลล์ติดอยู่กับฝาครอบ (โดยปกติหลังจาก 24 ชั่วโมง) ก็ถึงเวลาที่ต้องแก้ไขแล้ว การตรึงเป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากมันรักษาโครงสร้างเซลล์และรักษาโปรตีนไว้ในสถานที่ คุณสามารถใช้การตรึงเช่น 4% พาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) ในฟอสเฟต - น้ำเกลือบัฟเฟอร์ (PBS) เพิ่ม PFA เพียงพอที่จะครอบคลุมเซลล์บนฝาครอบและปล่อยให้มันนั่งที่อุณหภูมิห้องประมาณ 15 - 20 นาที

เมื่อการตรึงเสร็จสิ้นให้ล้างเซลล์สามครั้งด้วย PBS การล้างแต่ละครั้งควรใช้เวลาประมาณ 5 นาที สิ่งนี้จะช่วยลบการตรึงส่วนเกินออกจากเซลล์

การซึมผ่าน

ถัดไปคือการซึมผ่าน ขั้นตอนนี้อนุญาตให้แอนติบอดีเข้าสู่เซลล์และผูกกับโปรตีนเป้าหมาย ใช้ตัวแทน permeabilizing เช่น 0.1% Triton X - 100 ใน PBS เพิ่มโซลูชัน permeabilizing ให้กับเซลล์และปล่อยให้มันฟักตัวที่อุณหภูมิห้องประมาณ 10 นาที

หลังจากนั้นล้างเซลล์สามครั้งด้วย PBS อีกครั้งเช่นเดียวกับในขั้นตอนก่อนหน้า สิ่งนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าตัวแทนการซึมผ่านจะถูกลบออกอย่างสมบูรณ์

การปิดกั้น

การปิดกั้นเป็นขั้นตอนสำคัญในการป้องกันการผูกมัดที่ไม่เฉพาะเจาะจงของแอนติบอดี คุณสามารถใช้โซลูชันการบล็อกเช่น 5% Bovine Serum Albumin (BSA) ใน PBS เพิ่มโซลูชันการปิดกั้นให้กับเซลล์และปล่อยให้มันฟักตัวที่อุณหภูมิห้องประมาณ 1 ชั่วโมง

การฟักตัวแอนติบอดีปฐมภูมิ

ตอนนี้ถึงเวลาเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ แอนติบอดีปฐมภูมิมีความเฉพาะเจาะจงกับโปรตีนที่คุณต้องการตรวจจับในเซลล์ TET - 213 เซลล์ เจือจางแอนติบอดีปฐมภูมิในสารละลายบล็อกตามคำแนะนำของผู้ผลิต

ถอดสารละลายปิดกั้นออกจากเซลล์อย่างระมัดระวังและเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง ตรวจสอบให้แน่ใจว่าครอบคลุมเซลล์อย่างสมบูรณ์ด้วยสารละลายแอนติบอดี บ่มเซลล์ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ° C เวลาการฟักตัวที่ยาวนานนี้ช่วยให้แอนติบอดีผูกกับโปรตีนเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ในวันถัดไปล้างเซลล์สามครั้งด้วย PBS โดยการล้างแต่ละครั้งใช้เวลาประมาณ 5 นาที สิ่งนี้จะกำจัดแอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่ได้ผูกไว้

การฟักตัวแอนติบอดีรอง

หลังจากการบ่มแอนติบอดีปฐมภูมิถึงเวลาสำหรับแอนติบอดีรอง แอนติบอดีทุติยภูมิมีป้ายกำกับด้วยสีย้อมฟลูออเรสเซนต์ซึ่งช่วยให้เราสามารถมองเห็นโปรตีนเป้าหมายภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

เจือจางแอนติบอดีทุติยภูมิในโซลูชันการปิดกั้นตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลบ PBS ออกจากเซลล์และเพิ่มแอนติบอดีรองที่เจือจาง บ่มเซลล์ที่อุณหภูมิห้องประมาณ 1 - 2 ชั่วโมงในที่มืด สภาพแวดล้อมที่มืดเป็นสิ่งสำคัญในการป้องกันไม่ให้สีย้อมเรืองแสงซีดจาง

เมื่อการฟักตัวสิ้นสุดลงให้ล้างเซลล์สามครั้งด้วย PBS เหมือนเมื่อก่อน

การพนัน

counterstaining ใช้เพื่อให้เห็นภาพนิวเคลียสของเซลล์ คุณสามารถใช้สีย้อมอย่าง DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - Phenylindole) เจือจาง DAPI ใน PBS และเพิ่มลงในเซลล์ ปล่อยให้มันบ่มที่อุณหภูมิห้องประมาณ 5 นาที

หลังจากนั้นล้างเซลล์อีกครั้งด้วย PBS เพื่อลบ DAPI ส่วนเกินออก

การติดตั้ง

ในที่สุดก็ถึงเวลาที่จะติดตั้งฝาครอบลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ ใช้สื่อการติดตั้งซึ่งช่วยให้เซลล์อยู่ในสถานที่และยังคงรักษาฟลูออเรสเซนต์ไว้ วางสื่อการติดตั้งลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์อย่างระมัดระวังจากนั้นจึงกลับด้านบนลงไปที่หยด ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศติดอยู่ระหว่างฝาปิดและสไลด์

การถ่ายภาพ

ตอนนี้คุณพร้อมที่จะถ่ายภาพเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ใช้ตัวกรองที่เหมาะสมเพื่อให้เห็นภาพสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จากแอนติบอดีรองและ DAPI คุณสามารถถ่ายภาพได้หลายภาพในมุมมองที่แตกต่างกันเพื่อให้ได้การแสดงเซลล์ที่ดี

การใช้เปปไทด์ที่เกี่ยวข้องในกระบวนการ

ในระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์และกระบวนการย้อมสีคุณอาจพบว่าเปปไทด์บางอย่างมีประโยชน์ ตัวอย่างเช่น,(Gly14) -humanin (มนุษย์)ได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีผลประโยชน์บางอย่างต่อความมีชีวิตและการทำงานของเซลล์ คุณสามารถเพิ่มลงในสื่อการเพาะเลี้ยงเพื่อดูว่ามันมีผลต่อการแสดงออกของโปรตีนที่คุณกำลังศึกษาอยู่ในเซลล์ TET - 213 เซลล์หรือไม่

เปปไทด์ Fibronectin CS1สามารถใช้ในการเคลือบฝาปิดก่อนที่จะทำการเพาะเซลล์ สิ่งนี้สามารถเพิ่มการยึดติดของเซลล์และการแพร่กระจายทำให้กระบวนการย้อมสีมีประสิทธิภาพมากขึ้น

endothelin - 1 (11 - 21)อาจมีบทบาทในเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์ TET - 213 เซลล์ คุณสามารถเพิ่มลงในสื่อการเพาะเลี้ยงแล้วศึกษาว่ามันมีผลต่อการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายผ่านการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์อย่างไร

บทสรุป

การทำอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์การย้อมสีบน TET - 213 เซลล์อาจเป็นกระบวนการที่ยุ่งยากเล็กน้อย แต่ถ้าคุณทำตามขั้นตอนเหล่านี้อย่างระมัดระวังคุณควรจะได้ผลลัพธ์ที่ยอดเยี่ยม มันเป็นเทคนิคที่ทรงพลังที่สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีค่าแก่คุณเกี่ยวกับชีววิทยาของเซลล์เหล่านี้

หากคุณสนใจที่จะซื้อ TET - 213 เซลล์หรือเปปไทด์ที่เกี่ยวข้องที่กล่าวถึงในบล็อกนี้อย่าลังเลที่จะติดต่อเราสำหรับข้อมูลเพิ่มเติมและเริ่มการอภิปรายการจัดซื้อจัดจ้าง เราอยู่ที่นี่เพื่อช่วยคุณในทุกความต้องการทางชีววิทยาของเซลล์

การอ้างอิง

• Alberts, B. , Johnson, A. , Lewis, J. , Raff, M. , Roberts, K. , & Walter, P. (2002) ชีววิทยาโมเลกุลของเซลล์ วิทยาศาสตร์การ์แลนด์
• Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004) ชีววิทยาเซลล์ แซนเดอร์