วิธีการใช้สารตั้งต้นเปปไทด์ในการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติก

ในด้านการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติก สารตั้งต้นเปปไทด์มีบทบาทสำคัญใน โมเลกุลเฉพาะทางเหล่านี้เป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับนักวิจัยที่มุ่งทำความเข้าใจกลไกที่ซับซ้อนของการสลายโปรตีน รวมถึงความจำเพาะของเอนไซม์ การควบคุมกิจกรรม และรูปแบบการแตกแยกของสารตั้งต้น ในฐานะซัพพลายเออร์ซับสเตรตเปปไทด์ชั้นนำ เรามุ่งมั่นที่จะนำเสนอผลิตภัณฑ์คุณภาพสูงที่สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการวิจัยเอนไซม์โปรตีโอไลติกของคุณได้อย่างมีนัยสำคัญ ในบล็อกนี้ เราจะเจาะลึกรายละเอียดวิธีการใช้ซับสเตรตเปปไทด์ในการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติกอย่างมีประสิทธิภาพ

ทำความเข้าใจเกี่ยวกับสารตั้งต้นเปปไทด์

สารตั้งต้นเปปไทด์เป็นสายโซ่สั้นของกรดอะมิโนที่ออกแบบมาเพื่อเลียนแบบสารตั้งต้นตามธรรมชาติของเอนไซม์โปรตีโอไลติก พวกมันได้รับการออกแบบอย่างระมัดระวังเพื่อให้มีลำดับกรดอะมิโนจำเพาะที่รับรู้โดยโปรตีเอสเป้าหมาย เมื่อเอนไซม์โปรตีโอไลติกพบกับซับสเตรตเปปไทด์ที่เหมาะสม มันจะแยกซับสเตรตที่ตำแหน่งเฉพาะ ส่งผลให้มีการปล่อยผลิตภัณฑ์ที่แตกแยกออกมา เหตุการณ์ความแตกแยกนี้สามารถตรวจพบและวัดได้โดยใช้วิธีการที่หลากหลาย โดยให้ข้อมูลที่มีคุณค่าเกี่ยวกับกิจกรรมและความจำเพาะของเอนไซม์

การเลือกพื้นผิวเปปไทด์ที่เหมาะสม

ขั้นตอนแรกในการใช้ซับสเตรตเปปไทด์ในการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติกคือการเลือกซับสเตรตที่เหมาะกับความต้องการในการวิจัยเฉพาะของคุณ ควรพิจารณาปัจจัยหลายประการในระหว่างกระบวนการคัดเลือก

ความจำเพาะของเอนไซม์

เอนไซม์โปรตีโอไลติกที่แตกต่างกันมีความจำเพาะของซับสเตรตที่แตกต่างกัน ซึ่งถูกกำหนดโดยลำดับกรดอะมิโนที่อยู่รอบๆ บริเวณที่แตกแยก ตัวอย่างเช่น ทริปซินคือซีรีนโปรตีเอสที่แยกพันธะเปปไทด์ที่ด้านคาร์บอกซิลของไลซีนหรืออาร์จินีนที่ตกค้าง ดังนั้นเมื่อศึกษาทริปซิน คุณควรเลือกสารตั้งต้นของเปปไทด์ที่มีไลซีนหรืออาร์จินีนตกค้างที่ตำแหน่งร่องแตกที่เหมาะสม เรามีซับสเตรตเปปไทด์ที่หลากหลายซึ่งปรับให้เหมาะกับเอนไซม์โปรตีโอไลติกต่างๆ เช่นZ - LLY - FMK CAS 133410 - 84 - 1ซึ่งออกแบบมาสำหรับกิจกรรมโปรตีโอไลติกเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับโปรตีเอสบางประเภท

วิธีการตรวจจับ

วิธีการตรวจจับที่คุณวางแผนจะใช้ยังส่งผลต่อการเลือกวัสดุพิมพ์ด้วย มีวิธีการตรวจจับทั่วไปหลายวิธี รวมถึงการเรืองแสง การดูดกลืนแสง และการติดฉลากกัมมันตภาพรังสี สารตั้งต้นเปปไทด์ที่มีป้ายกำกับฟลูออเรสเซนต์ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลาย เนื่องจากมีการตรวจจับการทำงานของเอนไซม์แบบเรียลไทม์และละเอียดอ่อน การแตกตัวของซับสเตรตเปปไทด์ฟลูออเรสเซนต์ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งสามารถตรวจสอบได้อย่างง่ายดายโดยใช้เครื่องอ่านฟลูออเรสเซนซ์ ตัวอย่างเช่นซูค - IIW - บบสเป็นสารตั้งต้นเปปไทด์เรืองแสงที่สามารถใช้วัดกิจกรรมของโปรตีเอสบางชนิดได้ เมื่อซับสเตรตถูกแยกออกโดยเอนไซม์เป้าหมาย มอยอิตี AMC จะถูกปลดปล่อยออกมา และสามารถตรวจพบการเรืองแสงที่ความยาวคลื่นจำเพาะได้

เงื่อนไขการทดลอง

สภาวะการทดลอง เช่น pH อุณหภูมิ และความแข็งแรงของไอออนอาจส่งผลต่อประสิทธิภาพของซับสเตรตเปปไทด์และเอนไซม์โปรตีโอไลติก เอนไซม์บางชนิดทำงานภายใต้ช่วง pH ที่เฉพาะเจาะจง และความคงตัวของซับสเตรตเปปไทด์อาจได้รับอิทธิพลจากสภาวะเหล่านี้ด้วย ดังนั้นคุณจึงต้องเลือกวัสดุพิมพ์ที่เข้ากันได้กับเงื่อนไขการทดลองของคุณ ทีมสนับสนุนด้านเทคนิคของเราสามารถให้ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการใช้ซับสเตรตเปปไทด์ของเรา เพื่อให้มั่นใจถึงผลการทดลองที่ดีที่สุด

การเตรียมพื้นผิวเปปไทด์

เมื่อคุณเลือกซับสเตรตเปปไทด์ที่เหมาะสมแล้ว ขั้นตอนต่อไปคือการเตรียมเพื่อใช้ในการทดลองของคุณ ขั้นตอนทั่วไปในการเตรียมพื้นผิวมีดังนี้:

การละลาย

สารตั้งต้นเปปไทด์ส่วนใหญ่จะถูกจัดหาเป็นผงไลโอฟิไลซ์ หากต้องการละลายคุณควรใช้ตัวทำละลายที่เหมาะสม การเลือกใช้ตัวทำละลายขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของสารตั้งต้นและข้อกำหนดในการทดลองของคุณ สำหรับซับสเตรตเปปไทด์ที่ละลายน้ำได้ มักใช้สารละลายบัฟเฟอร์ เช่น น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) หรือบัฟเฟอร์ Tris - HCl สำหรับซับสเตรตเปปไทด์ที่ไม่ชอบน้ำ อาจจำเป็นต้องใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น ไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (DMSO) อย่างไรก็ตาม สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่าตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีความเข้มข้นสูงบางครั้งอาจยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ ดังนั้น ความเข้มข้นสุดท้ายของตัวทำละลายในส่วนผสมของปฏิกิริยาจึงควรได้รับการควบคุมอย่างระมัดระวัง

การกำหนดความเข้มข้น

หลังจากการละลาย คุณจะต้องกำหนดความเข้มข้นของสารละลายเปปไทด์ซับสเตรต ซึ่งสามารถทำได้โดยใช้วิธีการต่างๆ เช่น การวัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเฉพาะ ตัวอย่างเช่น หากสารตั้งต้นเปปไทด์ของคุณมีหมู่โครโมจีนิกหรือฟลูออโรจีนิกซึ่งทราบค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของฟันกราม คุณสามารถใช้กฎเบียร์ - แลมเบิร์ตเพื่อคำนวณความเข้มข้นของสารตั้งต้นตามการอ่านค่าการดูดกลืนแสง

การดำเนินการตรวจวิเคราะห์เอนไซม์โปรตีโอไลติก

เมื่อเตรียมซับสเตรตเปปไทด์ ตอนนี้คุณสามารถตั้งค่าการตรวจวิเคราะห์เอนไซม์โปรตีโอไลติกได้ ต่อไปนี้เป็นเกณฑ์วิธีทั่วไปสำหรับการทดสอบเอนไซม์ทั่วไป:

การตั้งค่าปฏิกิริยา

เตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยาที่มีซับสเตรตเปปไทด์ เอนไซม์โปรตีโอไลติก และบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่เหมาะสม บัฟเฟอร์ควรให้ค่า pH และความแข็งแรงของไอออนที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำงานของเอนไซม์ ส่วนผสมของปฏิกิริยามักจะบ่มที่อุณหภูมิเฉพาะตามระยะเวลาที่กำหนด อุณหภูมิและเวลาในการฟักตัวขึ้นอยู่กับลักษณะของเอนไซม์และวัตถุประสงค์ของการทดลอง ตัวอย่างเช่น เอนไซม์บางชนิดจะทำงานได้มากที่สุดที่อุณหภูมิ 37°C ในขณะที่เอนไซม์บางชนิดอาจต้องการอุณหภูมิที่ต่ำกว่าหรือสูงกว่า

การติดตามปฏิกิริยา

ในช่วงระยะฟักตัว คุณสามารถติดตามความคืบหน้าของปฏิกิริยาโปรตีโอไลติกได้ หากคุณใช้ซับสเตรตเปปไทด์แบบฟลูออเรสเซนต์หรือโครโมเจนิก คุณสามารถวัดการเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนต์หรือการดูดกลืนแสงในช่วงเวลาสม่ำเสมอโดยใช้เครื่องมือที่เหมาะสม การเพิ่มขึ้นหรือลดลงของสัญญาณเมื่อเวลาผ่านไปสะท้อนถึงความแตกแยกของเอนไซม์ของซับสเตรต

การวิเคราะห์ข้อมูล

หลังจากการฟักตัวแล้ว ให้วิเคราะห์ข้อมูลที่ได้จากขั้นตอนการเฝ้าติดตาม คุณสามารถคำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ตามอัตราการแตกแยกของซับสเตรต กิจกรรมของเอนไซม์มักจะแสดงเป็นปริมาณของซับสเตรตที่แยกออกต่อหน่วยเวลา ค่านี้สามารถใช้เพื่อเปรียบเทียบกิจกรรมของเอนไซม์ต่างๆ ศึกษาผลของสารยับยั้งเอนไซม์ หรือตรวจสอบอิทธิพลของปัจจัยต่างๆ ต่อการทำงานของเอนไซม์ ตัวอย่างเช่น หากคุณกำลังทดสอบผลการยับยั้งของสารประกอบต่อเอนไซม์ คุณสามารถวัดการทำงานของเอนไซม์ทั้งที่มีและไม่มีสารยับยั้ง และคำนวณเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งได้

การใช้สารตั้งต้นเปปไทด์สำหรับการคัดกรองสารยับยั้ง

สารตั้งต้นของเปปไทด์ยังมีคุณค่าอย่างมากในการศึกษาคัดกรองสารยับยั้งอีกด้วย สารยับยั้งสามารถใช้เพื่อควบคุมการทำงานของเอนไซม์ ตรวจสอบการทำงานของเอนไซม์ และพัฒนาสารที่มีศักยภาพในการรักษาโรคได้ ในการคัดกรองสารยับยั้งเอนไซม์โปรตีโอไลติกโดยใช้ซับสเตรตเปปไทด์ ให้ทำตามขั้นตอนเหล่านี้:

เตรียมสารละลายสารยับยั้ง

ละลายสารยับยั้งที่มีศักยภาพในตัวทำละลายที่เหมาะสมที่ความเข้มข้นต่างกัน ตัวทำละลายควรเข้ากันได้กับทั้งระบบยับยั้งและระบบวิเคราะห์เอนไซม์

ตั้งค่าการทดสอบสารยับยั้ง

เตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยาที่มีซับสเตรตเปปไทด์ เอนไซม์โปรตีโอไลติก และสารยับยั้งที่มีความเข้มข้นต่างกัน นอกจากนี้ ให้รวมปฏิกิริยาควบคุมที่ไม่มีสารยับยั้งด้วย บ่มส่วนผสมของปฏิกิริยาภายใต้สภาวะเดียวกับในการทดสอบเอนไซม์ปกติ

วัดผลการยับยั้ง

ติดตามการทำงานของเอนไซม์ในแต่ละส่วนผสมของปฏิกิริยาโดยใช้วิธีการตรวจจับแบบเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น เปรียบเทียบการทำงานของเอนไซม์ทั้งที่มีและไม่มีสารยับยั้งเพื่อพิจารณาผลการยับยั้ง คุณสามารถพล็อตกราฟขนาดยา - การตอบสนองเพื่อคำนวณค่า IC50 ซึ่งแสดงถึงความเข้มข้นของตัวยับยั้งที่จำเป็นในการยับยั้ง 50% ของการทำงานของเอนไซม์ สารประกอบเช่นสารยับยั้งคาลเพน XI CAS 145731 - 49 - 3สามารถใช้ในการตรวจคัดกรองสารยับยั้งดังกล่าวได้ และข้อมูลผลิตภัณฑ์ที่ครอบคลุมของเราสามารถช่วยคุณในการวางแผนและดำเนินการการทดลองเหล่านี้ได้

บทสรุป

สารตั้งต้นเปปไทด์เป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้ในการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติก ด้วยการเลือกสารตั้งต้นที่เหมาะสมอย่างระมัดระวัง เตรียมอย่างถูกต้อง และดำเนินการตรวจวิเคราะห์เอนไซม์ที่ออกแบบมาอย่างดี นักวิจัยจะได้รับข้อมูลเชิงลึกอันมีค่าเกี่ยวกับกลไกของการสลายโปรตีน ในฐานะซัพพลายเออร์สารตั้งต้นเปปไทด์ เราทุ่มเทเพื่อนำเสนอผลิตภัณฑ์คุณภาพสูงและการสนับสนุนทางเทคนิคอย่างมืออาชีพเพื่อตอบสนองความต้องการด้านการวิจัยของคุณ ไม่ว่าคุณกำลังศึกษาจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ คัดกรองสารยับยั้ง หรือสำรวจเป้าหมายการรักษาใหม่ๆ สารตั้งต้นเปปไทด์ของเราสามารถช่วยให้คุณบรรลุเป้าหมายการวิจัยได้

หากคุณสนใจที่จะเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับสารตั้งต้นเปปไทด์ของเรา หรือมีคำถามใดๆ เกี่ยวกับการใช้ในการศึกษาเอนไซม์โปรตีโอไลติก โปรดติดต่อเราเพื่อขอข้อมูลผลิตภัณฑ์โดยละเอียด และเริ่มต้นการสนทนาเรื่องการจัดซื้อจัดจ้าง ทีมงานที่มีประสบการณ์ของเราพร้อมที่จะช่วยเหลือคุณในการค้นหาผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับความต้องการการวิจัยเฉพาะของคุณ

อ้างอิง

• บาร์เร็ตต์, AJ และ Salvesen, GS (บรรณาธิการ) (1998). เอนไซม์โปรตีโอไลติก: แนวทางปฏิบัติ สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด.
• เติร์ก พ.ศ. และ Craik ซีเอส (2000) แนวทางการระบุสารยับยั้งโปรตีเอสที่ออกฤทธิ์เฉพาะที่ รีวิวสารเคมี, 100(12), 4159 - 4172.
• Rawlings, ND, บาร์เร็ตต์, AJ และ Finn, RD (2018) MEROPS: ฐานข้อมูลของเอนไซม์โปรตีโอไลติก สารตั้งต้น และสารยับยั้งในปี 2560 และการเปรียบเทียบกับเปปทิเดสในฐานข้อมูล PANTHER การวิจัยกรดนิวคลีอิก 46(D1) D624 - D632